动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留检测的固相萃取方法
（PolyClean X-HLB）
一、实验目的
本法为以 Polyclean X-HLB（60mg/3mL）柱开发的针对动物源食品（猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品）中硝基呋喃类代谢物残留检测的样本前处理净化方法，Polyclean X-HLB
（60mg/3mL）柱净化效果良好，回收率满足测试要求，重现性好，与知名厂商同型号柱性能相当。目标物采用反相高效液相色谱-紫外为检测手段。
二、实验目标物
四种硝基呋喃类代谢物：呋喃它酮代谢物 5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ， CAS:43056-63-9）、呋喃西林代谢物氨基脲（缩写 SEM，CAS:563-41-7）、呋喃妥因代谢物 1-氨基-2-内酰脲（缩写 AHD，2827-56-7）和呋喃唑酮代谢物 3-氨基-2-噁唑烷基酮（缩写AOZ,80-65-9）。
三、应用范围
本方法适用于动物源性食品包括猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类、虾蟹类和贝类）中硝基呋喃类代谢物残留检测。
四、参考标准
参考国家标准《GB/T 20752-2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》和农业部公告《农业部 1077 号公告-2-2008 水产品中硝基呋喃代谢物残留量的测定》
五、实验材料
NuAnalytical Polyclean X-HLB 固相萃取柱 60mg/3mL。六、实验方法
1、 样品待测溶液制备
（1）样品称取脱脂
称取待测样品 2g（精确到 0.01g），置于 50mL 离心管中加入 10mL 甲醇-水混合物（2+1），振荡混匀 10min，4000r/min 离心 10min，吸取清液弃掉、离心管中试样备用。
（2）水解衍生化
向上述离心管中加入 20mL0.2mol/L 盐酸，振荡混匀 10min，后加入 0.4mL 0.05mol/L 2-硝基苯甲醛（0.075g 2-硝基苯甲醛溶于 10mL 二甲亚砜），涡旋混匀 1min，置于 37℃恒温振荡器水浴中避光反应 16h。
将上述衍生液，放置至室温，加入 5mL0.1mol/L 磷酸氢二甲溶液，用 1mol/L NaOH 调节 pH 到约 7.4，4000r/min 离心 10min，上清液（对脂肪含量多的试样，可加入 5mL 正己烷，振荡 2min，4000r/min 离心 5min 吸取并弃掉正己烷）备 HLB 柱萃取净化用。
2、活化
依次用 5mL 甲醇、10mL 水活化。
3、上样和洗脱
取上述备用液控制流速小于 2 mL/min 过柱。待样液全部通过后用 10mL 水淋洗上样柱， 弃去全部流出液并真空抽干，最后用 5 mL 乙酸乙酯洗脱柱子上的待测成分。
4、重新溶解
收集洗脱液，于 40 ℃氮气吹干，准确加入 1.0 mL 乙腈/水（1/2，V/V）溶液溶解残余物混匀，0.22 μm 滤膜过滤，供高效液相色谱测定。
5、HPLC 条件
色谱柱：SuperLu C18 (250×4.6mm，5μm)
检测器：Waters 2487 紫外双波长检测器；检测波长：275nm
流动相：A-乙腈 B- 0.01mmol/L 乙酸铵（0.77g 乙酸铵，1000mL 水溶解，甲酸调 pH
3.5 ）
洗脱方式：梯度洗脱，梯度条件如下：
时间/min
A/%
B/%
0.01
15.0
85.0
16.50
40.0
60.0
17.00
15.0
85.0
22.00
15.0
85.0
柱温：30℃ 流速：1.0 mL/min 进样量：20μL七、实验结果
1、添加水平为 0.5mg/kg 猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的添加回收结果
表 1 添加水平为 0.5mg/kg 猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的添加回收结果
回收率（%）
代谢物衍生物名称
平均回收率（%）
RSD（%）
1
2
3
NP-AMOZ（呋喃它酮代谢物衍生物）
97.2
102.0
97.4
98.9
2.7
NP-AOZ（呋喃唑酮代谢物衍生物）
98.2
98.8
94.6
97.2
2.3
NP-AHD（呋喃妥因代谢物衍生物）
94.6
101.6
96.8
97.7
3.7
NP-SEM（呋喃西林代谢物衍生物）
96.6
97.6
94.2
96.1
1.8
2、添加水平为 0.5mg/kg 猪肉基质中四种硝基呋喃代谢物衍生物的紫外检测色谱图
图 1 添加水平为 0.5 mg/kg 猪肉中硝基呋喃代谢物衍生物检测的液相色谱图
