制备型液相色谱（LC）简介
色谱是根据混合物中各组分的化学特性对其进行分离的一种分离方法。制备型(Prep)色谱或纯化色谱则是指利用色谱方法分离出一定量达到足够纯度的化合物用于后续实验或处理的色谱方法。科学家首先要确定目标化合物，然后开发色谱方法，将目标化合物从原料、副反应或其它杂质中成功分离出来。其总体目标是满足日益增长的高通量和高效率需求，同时运用各种纯化技术达到相应的规模、纯度和重现性要求。
从大型制药企业到小规模天然产物研究团队，纯化色谱在众多科研机构中应用非常广泛。尽管应用领域各不相同，用户的一般要求却非常相似，他们都希望分离出的终产物纯度能达到95％或更高。
本初学者指南旨在为液相色谱工作者介绍快速发展的LC纯化领域，内容包括色谱分离方法开发、方法放大所需的数学公式以及常用的馏分收集模式等基本原理。鉴于大多数制备型LC应用都使用反相分离模式，本指南将主要介绍该分离模式。
采用液相色谱进行纯化
LC纯化系统的配置与一般液相色谱系统相同，但增加了馏分收集器。样品混合物被进样至色谱柱，色谱柱根据组分特有的化学或物理性质对其进行分离。检出组分时，系统会将其输送至废液，或者进行收集用于后续实验。洗脱液收集操作既可由分析人员在组分洗脱时通过简单的手动方式完成，也可以全自动进行，在自动收集操作中，检测器信号会触发馏分收集器将液流输送至收集容器中。输送至收集容器的馏分纯度取决于分离过程中化合物与其它邻近洗脱杂质的分离度。
图1：制备型LC系统
判断纯化分离成功与否的标准包括通量、回收率和所得分离物的纯度。纯化分离由色谱峰的分离或“分离度”驱动。以下是对分离度影响最为显著的色谱参数：
- 色谱柱填料（固定相）
- 溶剂强度
- 溶剂类型
- 缓冲液添加剂
- 柱温
通过执行方法开发工作流程，可确定实现理想分离度的条件。该工作流程非常简单，但包含多个步骤，各步骤的复杂性和必要性根据样品的独特性质而异。无论样品分离用于何种应用、采用哪种模式（例如反相色谱、离子交换色谱等），方法开发工作流程通常都是相同的。
图2：通用制备型工作流程
在设计工作流程之前，十分重要的考虑因素是目标化合物的性质。如果从熟知的来源或新来源中分离已知化合物，很容易通过检索相关文献获取有关目标化合物色谱行为的信息，并从已发表的方法中选择适用的分离方法。而对于含有未知类型化合物的粗提取物，设计分离方案的难度较大。在这种情况下，可在初始分离之后进行一系列探索性实验，获取更多有关目标化合物的信息，例如pKa、分子量、溶解性、稳定性、UV光谱和生物活性等。然后根据这些信息修改初始分离方法，使其符合化合物的化学和物理性质要求。这些信息不仅有助于方法开发，还可以在收集到馏分之后，为掌握目标产物的稳定性提供非常大的帮助。
第一步要制备样品并使用快速探索梯度执行常规分离。这一步通常为小规模分离，目的是节省宝贵的样品。根据该分离的结果，可以计算洗脱目标化合物的溶剂条件并进一步优化分离条件，尽可能提高分离度。此外，可能还需要对上样量进行研究，确定可维持适当分离度以实现高纯度分离的理想上样量。
确定分离方法和理想上样量后，通常要针对具有应用前景或潜在价值的分离物进行方法放大（但并不是必须执行）。在本初学者指南中，术语“规模”(scale)旨在描述满足产物纯度、通量和收率等应用目标所需的仪器和方法。若要“放大”(scaled-up)方法，则需要将方法转换至硬件配置可处理更高上样量的系统。从本质上来讲，方法放大就是借助一系列方法放大计算和硬件更改，在分离度保持不变的前提下，将方法从分析级内径色谱柱转换到制备级内径色谱柱的过程。
图3：用于分析级和制备级纯化的色谱柱内径对比
样品
可用于分离特定化合物的样品来源十分广泛，包括药物中间体、天然产物、保健食品、饮料和工业产品等。只要原料可以进行提取并溶解于液体基质中，就可以使用色谱纯化其中的各组分。
样品提取技术的选择取决于待提取原料的复杂性。对于天然产物，通常将样品干燥并研磨成细颗粒用以提高提取效率。接下来采用渗滤（用于大体积样品）或浸提（用于小体积样品）等技术提取目标化合物。这两种技术都需要向样品原料中加入溶剂，然后在超声、涡旋或浸泡后收集溶质。收集提取物之后，和所有HPLC样品一样，样品在进样前必须过滤，以除去颗粒并排除气泡。
分离模式
制备型色谱主要有四种分离模式：反相、正相、凝胶渗透和离子交换。合适的分离模式取决于待分析样品、提取物或混合物与固定相和溶剂之间的相容性。
反相色谱是开发纯化方法时最常用的技术，其使用极性弱于洗脱溶剂极性的固定相。反相色谱使用水与乙腈或甲醇的混合物作为洗脱液，其中还会添加缓冲液（酸或碱）用于控制样品的离子化程度以及结合固定相中未反应的游离硅醇基团。硅胶型固定相中的键合相材料或吸附剂采用甲硅烷基化试剂进行了衍生化处理，可减少峰拖尾并提高色谱重现性。上述衍生化试剂处理（硅烷化）以及不同的碳载量将赋予不同制造商的色谱柱独特的分离特征¹。
快速启动方法开发
建立反相分离方法时，通常选择小规格的分析型色谱柱（内径≤ 4.6 mm），并且其柱长和填料应可扩展至较大规格（内径≥ 10 mm）内径的色谱柱，以便将来放大方法。方法开发的关键是找到可实现出色分离的适用溶剂体系。对于酸性化合物，通常采用pH为酸性的水性流动相，并以甲醇或乙腈作为强溶剂。浓度为0.1%的甲酸是常用的缓冲液添加剂，因为其兼容UV和质谱检测。如需鉴定未知化合物或获取纯分离物用于进一步研究，MS兼容性将非常有用。如需让碱性分子保持未电离状态，可使用pH为碱性而非酸性的流动相。使用任何pH的缓冲液之前，都应参阅色谱柱固定相说明书了解其兼容性。水性流动相通常由位置A处的泵泵送，强溶剂由位置B处的泵泵送。本初学者指南将分别使用“A”和“B”指代泵表中的水性溶剂和强溶剂。
探索
尽管复杂的分离受色谱柱填料选择性的影响最大，但在开发纯化分离方法时，通过快速探索梯度得到初始样品分离方法并优化是十分有效的方法开发途径。探索梯度的作用是大致确定从色谱柱上洗脱目标化合物所需的溶剂浓度。探索梯度一般从一致的强溶剂浓度(2%-10%)开始，线性增加至25%、50%、75%和90%-95%。
表1：快速线性梯度探索研究示例
图4：快速探索梯度。随着梯度斜率减小，分离度增大²
运行探索梯度之后，在进行下一步之前应审查并评估所得结果，弄清以下问题：
- 快速探索梯度的分离度是否足以分离目标化合物？
- 快速探索梯度的速度或效率是否满足要求？
- 采用所需上样量时，目标化合物与其它峰能否保持分离？
如果探索梯度结果未达到要求，可通过方法聚焦进行优化，也可通过更改pH值、溶剂或其它色谱变量对分离方法进行整体调整。
优化方法
通过改变强溶剂和弱溶剂组成可优化目标化合物分离度理想的探索梯度。溶剂组成可以保持恒定（等度），也可以根据给定的单位时间或色谱柱体积进行变化（梯度）。
等度洗脱
在等度分离中，弱溶剂和强溶剂比率在单位时间内保持不变。等度溶剂可由分析人员离线制备，或使用能以恒定的预定流速配比不同溶剂的HPLC泵通过在线混合制得。这种洗脱模式便捷、一致且稳定，因为在系统间转移方法时，延迟体积对保留时间的影响可以忽略不计。
等度洗脱有一定缺陷，并不是所有分离都适用。它的一些固有问题包括：早期洗脱峰分离度低、因峰拖尾导致峰对称性不佳、由于谱带增宽导致灵敏度降低，以及由于强保留化合物积累导致色谱柱污染问题等。
梯度洗脱
反相色谱或离子交换色谱中的梯度分离通常在线混合流动相，以便在整个分析过程中使有机溶剂比例稳定升高。梯度开始时，溶剂强度较低，分析物会被分配到固定相中或保留在色谱柱柱头。随着溶剂强度增加，分析物被转移到流动相，沿色谱柱移动，最终被
洗脱。
梯度洗脱可在合理的时间范围内分离疏水性不同的多种分析物。另外，梯度洗脱还可提高峰分离度，由于峰高增加，灵敏度也有所提升。强保留组分会在运行结束时从色谱柱中洗脱出来，因此还可尽可能减少色谱柱污染。
当然，梯度洗脱也存在一些弊端。该方法要求实现一致、无脉冲的在线梯度混合，因此通常需要昂贵的泵设备。此外，采用某些溶剂的组合混合流动相时，可能会产生沉淀。由于梯度结束后需要重新平衡，运行时间会很长，而且因为仪器驻留时间(Vd)不同，若
不适当使用补偿溶剂，会带来方法转换问题。
线性梯度
在整个运行过程中，线性梯度的强溶剂比例以恒定速率增加。该方法常在快速筛选实验中被用于快速确定洗脱目标峰的溶剂比例，同时保持较短的运行时间，从而缩短洗脱时间并降低溶剂成本。
图5：线性梯度的溶剂曲线
分段梯度
分段梯度是多个线性梯度的组合，每个区段具有不同的斜率或陡度。平缓的区段用于分离目标化合物，而陡峭的区段是对色谱图分离度要求不高的区域（例如分离后的清洗过程）。
图6：分段梯度的溶剂曲线
梯度聚焦
梯度聚焦通常比分段梯度的运行时间更短且变化更大。一般情况下，刚进样时流动相的溶剂强度非常低，接下来溶剂强度会迅速升至洗脱目标化合物所需的溶剂比例以下2%-5％（例如，洗脱浓度22% - 2％ = 20％开始平缓梯度）。然后运行平缓梯度，梯度斜率约为快速探索分离所确定的斜率的1/5，最后终止于目标化合物的洗脱浓度以上2%-5％（例如，22% + 2% = 24%终止平缓梯度）。最后，溶剂百分比快速增加，用以清洗残留在色谱柱中的所有样品组分。
图7：梯度聚焦的溶剂曲线
开发梯度聚焦
采用快速探索梯度分析样品之后，可利用以下公式为目标化合物开发梯度聚焦。每个公式之后都附有理论示例。
首先必须确定探索梯度运行所用仪器的系统延迟体积。关于延迟体积测定的说明可参阅本初学者指南的“延迟体积测定”部分，或访问www.waters.com/prepcalculator ，使用“分析级至制备级梯度转换器”应用工具获取。
此外，还需确定探索梯度运行所用色谱柱的柱体积。使用圆柱体体积V = πr²h和除去填料所占体积之后的可用柱体积比例可计算出该值，例如V = πr²h (66%)。“分析级至制备级梯度转换器”应用程序工具也可用于执行此计算。
公式1：色谱柱体积
公式2：梯度形成和检测器之间的补偿体积
公式3：到达检测器所需的时间到达检测器所
公式4：达到洗脱浓度的时间
公式5：洗脱浓度(%)
公式6：色谱柱体积(CV)数
公式7：探索梯度斜率
公式8：梯度聚焦斜率
梯度聚焦区段为：估算洗脱比例以下5%至该比例以上3%~5%。例如，洗脱比例为79％。
公式9：梯度聚焦区段的时长
最后一步是使用上述公式计算出的值创建梯度聚焦。
探索梯度:
|
时间 (mins) |
流速 (mL/min) |
溶剂 |
|
|
%A |
%B |
||
|
0.00 |
1.5 |
95 |
5 |
|
7.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
8.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
9.00 |
1.5 |
95 |
5 |
梯度聚焦:
|
时间 (mins) |
流速 (mL/min) |
溶剂 |
|
|
%A |
%B |
||
|
0.00 |
1.5 |
95 |
5 |
|
1.00 |
1.5 |
26 |
74 |
|
4.32 |
1.5 |
16 |
84 |
|
6.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
7.00 |
1.5 |
95 |
5 |
图8：采用快速梯度和梯度聚焦分离萘普生、苯氧苯丙酸、双氯芬酸和异丁苯丙酸所得的结果对比。可以看到用星号标记的目标峰在梯度聚焦分离中分离度更高且保留时间更短
替代方法开发
如果等度分离或梯度聚焦都不能完全分离目标化合物，可以通过更改溶剂、pH值、固定相和/或温度重新开发分离方法。这类修改会对分离产生显著影响，因此进行以上任何更改之后都必须运行探索梯度并进行方法优化。
溶剂
HPLC流动相由三种组分组成：弱溶剂、强溶剂和改性剂。溶剂必须具有高纯度、可与检测器兼容、不与样品反应，并且粘度应较低，以保持低系统背压。
反相色谱通常以水作为弱溶剂，常用的强溶剂是乙腈和/或甲醇，因为它们粘度低、溶剂强度高，并且在短波长范围内兼容UV检测。此外，乙腈和甲醇还能提供理想峰形，分离之后易于通过蒸发去除，而且不与大多数样品反应。
和所有用于色谱分离的溶剂一样，分析样品时必须保持检测波长高于已知的溶剂UV截止波长值。若波长低于该值，检测器会将溶剂组分变化记录为基线漂移或其它色谱干扰。
表2：常用色谱溶剂及其UV截止波长
峰分离和出峰顺序会根据分离所用的强溶剂不同而改变。预测可使目标化合物达到最高分离度的溶液非常困难，因此，通常需要通过试错法来确定强溶剂。或者，也可以使用混合强溶剂（例如，50:50乙腈/甲醇）达到理想的洗脱顺序或分离度。
图9：乙腈和甲醇的洗脱顺序对比³
pH值
流动相pH值是控制反相分离保留性的一个非常重要的变量。化合物通常都含有一个或多个酸性或碱性官能团，因此大多数反相流动相的pH值都有必要加以控制。
当酸的pH高于或低于其pKa 2个以上pH单位时，99％以上的酸将分别处于电离或未电离状态。相反，碱在pH值低于其pKa时电离，在pH值高于pKa时为未电离状态。未电离物质的极性较小（更疏水），因而在反相体系中保留性更强。因此，酸在低pH值条件下保留性更好，而碱在高pH值条件下保留性更好⁴。
图10：流动相pH值对分析物保留性的影响。选择对应于保留图稳定区域的流动相pH值可实现十分稳定的分离。非电离形式的酸和碱保留性非常理想，而中性分析物的保留性不受pH值影响
如果流动相pH值接近目标化合物的pKa，则很小的pH值变化也会显著影响其保留性，从而直接影响分离稳定性。我们通过添加缓冲液来控制流动相pH值。加入少量酸或碱时，缓冲液可保持pH值不变。缓冲液在其pKa ±1个pH值单位范围内使用十分有效，不过有的缓冲液在其pKa ±2个pH值单位范围内也具有足够的缓冲能力。
图11：化合物选择性与pH值。酸性和碱性化合物的洗脱顺序因其电离情况不同而发生了显著变化，而中性化合物未受影响
在选择运行pH值时，还应考虑色谱柱稳定性。硅胶基色谱柱在pH 2至pH 8之间性能非常理想。键合相在低pH值下易水解，而在高pH值下，硅胶主链会变得易溶解。当pH值高于8时，需要使用非硅胶基质颗粒或具有专用键合相（在高pH值条件下稳定）的颗粒。pH值限值和通用处理建议可参阅色谱柱说明书或访问色谱柱制造商网站。
图12：基于沃特世表面带电杂化(CSH)硅胶基质的专用键合相示例及其建议pH值范围
当色谱方法用于纯化目的时，用于调节pH的缓冲液添加剂必须具有足够的挥发性，以便从纯化后的分离物中去除。此外，使用挥发性添加剂时，必须注意避免MS源被污染或产生沉淀。甲酸、乙酸和醋酸铵等常用添加剂以0.05%~0.1％的浓度溶解于流动相时性能非常理想。不建议在纯化或MS应用中使用液相色谱分离最常用的缓冲液添加剂 - 磷酸盐。
建议的缓冲液浓度为5~10 mM。如需使用缓冲液，应在制备完成后进行过滤，不使用时应冲洗泵管路，以避免在线沉淀，还需定期更换溶液以防止微生物生长积聚。
图13：流动相缓冲液选择指南，附MS兼容性
固定相
色谱柱固定相会显著影响分离。反相色谱使用C18到C8的固定相，某些固定相还含有专为提高选择性和分离能力而设计的键合相。许多实验室的色谱柱库存有限，因此更换固定相通常是调整溶剂和pH值均无法达到足够分离度时的最后选择。沃特世常见色谱柱选择卡(www.waters.com)可对比不同制造商色谱柱固定相的选择性。在方法开发的早期阶段，该工具非常适合用于比较色谱柱选择性。
图14：沃特世常见色谱柱选择卡，可通过www.waters.com/selectivitychart 上的Web Toolbox（网络工具箱）访问
柱长
色谱柱柱长也是影响分离性能的因素之一。市面上有多种色谱柱柱长可供选择，包括25 mm、50 mm、100 mm、150 mm和250 mm。较短的色谱柱塔板数较少，适用于快速分离，而较长的色谱柱塔板数较多，因此保留时间较长。随着柱长增加，柱压、运行时间、溶剂消耗量和成本也会相应地增加，因此能够达到足够分离度的尽可能短的色谱柱是十分理想的选择。
图15：不同柱长色谱柱的分离度对比。100 mm色谱柱改善了主峰与邻近杂质之间的分离度，总运行时间随柱长增加而延长³
粒径
样品流经填料时，色谱柱阻止样品谱带扩散或展宽的能力称为“柱效”。由于小颗粒内的峰扩散较低，小粒径色谱柱的柱效更高。高柱效可使峰宽更窄，赋予色谱柱更强的分离能力。
制备型色谱柱的粒径通常为5~10 μm，超高压分析型分离则使用粒径为1.7~3.5 μm的色谱柱。虽然极小的粒径可带来更高的柱效，但代价是色谱柱成本和系统背压增加。出于以上原因，以较高流速分离粗制样品混合物的大规模制备型色谱柱一般不会采用粒径非常小的颗粒。
图16：采用不同粒径色谱柱分离相同物质的色谱结果对比³
温度
由于不同的温度会影响色谱选择性，因此加热色谱柱是优化具体样品分离结果的一种非常方便的手段。流动相粘度和系统整体压力随温度升高而降低，进而降低系统、接头和色谱柱压力，最终有利于提高运行的稳定性。调节温度还可缩短保留时间并改变分离的选择性。峰分离度会随温度变化增大还是减小很难预测，因而温度对于每次具体分离有特定的影响。
尽管温度控制是小规模色谱的常规控制手段，但制备级纯化很少将温度作为操控色谱分离的参数。首先，大内径色谱柱难以从外部均匀加热。其次，大规模的高流速分离中通常会保持流入溶剂的温度。虽然电热毯和柱温箱可满足小规模分离的加热需求，却无法在直径方向上均匀加热大型色谱柱。因此，色谱柱直径方向上会形成温度梯度，对色谱分离产生不利影响。
若必须借助温度控制来保持样品溶解性，可在制备型色谱柱柱头处连接一段管路，并将其放置在加热的水浴中，以消除温度梯度。这一段管路被用作预加热器，将流入溶剂平衡至所需温度⁵。将来需要放大的色谱方法最好在室温条件下开发，尽量不使用温度控制手段。
图17：制备级色谱柱加热。制备型色谱柱柱头连接的5 mL定量环浸没在水浴中，用作溶剂预加热器⁵
方法放大
若初步证明某分离物具有潜在价值，可“放大”分离方法，分离出更大量的该分离物以供进一步评估。要在大规模分离中维持小规模分离的各项属性（如分离度等）很容易。必须借助已定义的数学公式修改流速、上样量和系统硬件参数，从而有效地将分离方法
转移至更高容量的色谱柱。
方法放大的第一阶段通常是获取mg级到g级的分离物用于从早期生物学评价到建立具有改进治疗特性的产品类似物的结构 - 活性关系等多种用途。方法放大的下一阶段需要获取100 g到数千克（或更多）的目标物质用于临床前和临床开发，如果开发成功，将最终决定全面投产。这种规模的分离要用到良好生产规范(cGMP)等指导文件和质量控制手段¹。
表3：色谱规模、目标物质量和相关应用。
方法放大工作流程分为几个步骤。必须保证放大计算的准确性，否则最终可能无法达到小规模分离的分离度。为了提高方法放大的成功率，同时维持保留时间和选择性不变，需要仔细考虑以下要求：
- 小规模和大规模分离必须使用相同的流动相。
- 使用填料、柱长和粒径相同的色谱柱非常容易进行方法放大（或者在保持初始方法的柱长-粒径比率(L/dp)不变的前提下改变粒径）。
- 应使用相同的稀释溶剂制备浓度相同的样品。
图18：方法放大工作流程。
确定延迟体积
在放大方法或更改系统时，延迟体积（即系统体积或死体积）对于维持早洗脱峰的峰分离度很重要。延迟体积是指梯度形成处到色谱柱柱头之间的体积。在高压混合LC系统中，该体积主要包括混合器、连接管路和自动进样器定量环的体积。低压混合系统包括来自泵的上游溶剂，因此这些额外的管路体积加上泵头（一个或多个）体积，再加上混合器、连接管路和自动进样器定量环的体积共同组成了总延迟体积。
图19：导致延迟体积的纯化流路组件（用虚线圈出）。
等度分离的流动相组分通过在线方式混合，这种情况下仍然存在延迟体积，但由于流动相浓度恒定，色谱分离结果中观察不到差异。另一方面，梯度方法则依赖流动相浓度随时间的变化实现峰分离。在梯度方法中补偿延迟体积可确保峰保留时间得以维持，需要收集纯馏分时，这一点尤为重要。
如需测定延迟体积，可根据www.waters.com/prepcalculator 上的“分析级至制备级梯度转换器”所用的方法，采用流动相A和含有UV吸收能力不同的添加剂（例如0.05 mg/mL尿嘧啶或0.2％丙酮的乙腈溶液）的流动相B溶剂组成分级梯度进行测定。
表4：确定延迟体积的步骤。
图20：用于测定分析型系统和制备型系统的系统体积的分级梯度。
色谱柱容量
在纯化色谱分离中，保持目标化合物具有足够的分离度是一个关注重点。色谱柱容量（或称上样量）以化合物与邻近峰的分离度为衡量标准。虽然色谱柱容量主要受色谱柱柱长和内径影响，样品溶解性和样品混合物的复杂性等其它因素对此也有一定影响。色谱柱容量的趋势如下：
- 色谱柱容量主要取决于具体样品的溶解性。
- 简单混合物的色谱柱容量更高。
- 如果需要较高的分离度，应降低色谱柱容量。
- 色谱柱容量在很大程度上取决于上样条件。
表5：常用制备型色谱柱规格的估计上样量(mg)。
示例：以4.6 x 50 mm的色谱柱为例，其预计上样量为每20 μL进样对应3 mg。
在方法放大之前，应通过上样量研究来确定特定目标化合物的理想上样量。这些研究以小规模进行，并采用以下其中一种方法：制备高浓度样品，然后逐步增大进样体积；或者制备多个浓度的样品，进样体积保持恒定。这两种方法的目标都是在保持目标化合物与邻近杂质之间具有足够分离度的前提下，确定可进样的最大样品浓度或进样体积。确定色谱柱容量后，可利用公式将其放大，以便用于内径更大的色谱柱和大规模工作流程。
图21：上样量研究。可以看到星号标注的峰的分离度随上样量增大而降低。
公式10：上样浓度放大
因此，要将4.6 mm x 50 mm分析型色谱上1800 μg (1.8 mg)的上样量等效放大至19 mm x 50 mm制备型色谱柱：
公式11：进样体积放大
要放大20 μL的进样体积：
柱头稀释
DMSO等强溶剂可以改善样品溶解性，进而可能增大色谱柱容量。然而，进样大体积的强溶剂会导致色谱峰畸变，这反而会减少可成功分离的产物量。若强溶剂从进样器输送到柱头的过程中在水性溶剂流中间形成溶剂簇，就会导致峰畸变。溶剂簇边缘的强样品溶剂被水性溶剂稀释，可能会引起样品沉淀，这种沉淀可能会堵塞流路塞，进而导致高压系统关闭。
图22：流动相在色谱柱内稀释样品簇。如果使用强稀释剂制备样品，则样品簇在流经含有水性流动相的色谱柱时，样品簇边缘可能会产生沉淀。
如果沉淀没有导致系统关闭，样品将进入色谱柱，但色谱柱上不会有样品被保留，直到样品簇被流动相稀释。进样体积较大时，样品簇必须沿着色谱柱移动相当长的一段距离才能达到所需的稀释度。在这种情况下，样品沉积为宽谱带，占据大部分色谱柱体积，这会导致需要大量洗脱液才能洗脱出很宽的峰，且峰分离度不足。通过严格限制进样体积和上样量可以避免这种情况。替代方法是用水或弱溶剂对样品进行充分稀释，以确保足够的保留性能。
图23：将样品溶于强溶剂中进样的传统进样方法。样品簇在沿着色谱柱移动的过程中被稀释，会导致峰畸变。
由于通量和回收率受到影响，上述两种方法都不理想。柱头稀释系统采用另一种配置，能够在色谱柱入口处使用水性稀释剂流对输送至此的样品簇进行连续稀释。输送至色谱柱的流速非常快，因此不会产生沉淀。接下来，样品分子会被吸附到填料上，形成非常窄的谱带，进而被洗脱为分离良好的小体积峰。柱头稀释还使得样品不容易在定量环或柱头处发生沉淀，因此能改善系统稳定性。由于样品组分峰之间的分离度得以改善，我们可以增大进样量，从而减少分离所需的进样次数。在实际操作中，采用柱头稀释通常可将色谱柱上样量提升3~5倍。发生高压关闭的频率降低，色谱柱寿命也更长。
图24：柱头稀释系统。样品簇被输送到色谱柱入口，并在此经水性稀释剂流连续稀释，因而不会产生沉淀。样品谱带可洗脱为具有理想分离度的小体积峰⁶。
图25：采用传统进样方法和柱头稀释法进样溶于强溶剂的样品结果对比。柱上进样量为1000 μL（相当于133 mg）³。
流速放大
为了在放大过程中保障分离质量，小规模和大规模色谱柱的线性流速必须保持恒定，因此在柱长、粒径和填料相同的大规模和小规模色谱柱之间进行流速放大效果十分理想。放大流速时必须考虑系统的硬件能力，例如最大泵流量和背压限制。如果硬件无法满足流速要求，应考虑更换合适的仪器以满足放大要求。
公式12：流速放大
例如，假设分析型色谱柱(5 μm, 4.6 mm x 50 mm)的流速为1.5 mL/min，则制备型色谱柱(5 μm, 19 mm x 50 mm)的流速通过以下公式计算：
梯度持续时间放大
一般来说，如果可通过调节流速保持流动相线性速度不变，进行方法放大时不需要更改梯度。如果柱长不同，则必须计算梯度时间，以保持小规模分离时的分离度和保留时间。
公式13：梯度时间放大
例如，50 mm分析型色谱柱上持续5 min的线性梯度区段在100 mm制备型色谱柱上应为10 min：
制备转换器
上样量、流速和梯度的放大计算也可以通过制备型OBD方法转换器执行。该转换器是一款操作简单的应用程序，可执行所有分析级到制备级的放大计算，包括上样量、系统体积、流速、溶剂体积消耗量、质谱引导的色谱分离方法的分流比计算，以及梯度聚焦UPLC方法到制备级方法的转换等。您可以通过www.waters.com/prepcalculator 或沃特世纯化软件（如ChromScope™）访问该应用程序。
图26：沃特世制备型OBD方法转换器，可通过www.waters.com/prepcalculator 上的Web Toolbox（网络工具箱）访问。
