如何用好HILIC,菲罗门帮您选择色谱柱！

亲水相互作用色谱长期被人们使用，但是HILIC这个名词仅仅是最近才被使用。
分析物通常是极性化合物，如极性代谢物，碳水化合物或肽。
HILIC 可以被看作正相色谱向水性流动相领域的延续。
流动相是水相缓冲液(< 40%)及有机溶剂。
固定相是强亲水性的极性吸附剂，如硅胶键合相，极性聚合物填料或离子交换吸附剂。
这些固定相的共同特点是它们和水的作用力很强，因此属于“亲水性”。

HILIC模式使用的梯度和反相模式相反。初始条件包括高比例有机相，典型的浓度是95%有机相如乙腈，逐步降低到水相。
因此，HILIC色谱又被称为反反相色谱（reversed-reversed-phase）。

亲水相互作用色谱属于正相色谱。

它与反相色谱有着相反的作用方式：亲水性低(疏水性强)的化合物将会先被溶出。
使用C18柱分析亲水性化合物时，一般都要使用离子对试剂。
而由于HILIC不需使用任何离子对试剂，所以由离子对试剂引起的平衡时间长，色谱柱劣化加快，流动相调制复杂等诸多问题都将不复存在。
另外，HILIC的固定相三唑基具有阴离子交换作用，此作用对酸性化合物有较强的保留能力。

特点：

• 键合相采用特殊的酰胺基团，适用于分离小分子糖等物质

• 较普通C18更适合分离强极性、高水溶性、碱性有机化合物

• 可替代传统的氨基柱和硅胶柱，具有更好的重现性和寿命

HILIC 是一种亲水作用色谱模式，其洗脱是以化合物亲水性/ 极性增加的次序排列，典型的流动相是乙腈（40%--97%）－水（或挥发性缓冲盐），同时它可以使用更高挥发性的流动相或缓冲盐，增加了HILIC 色谱的LC/MS 分析灵敏度，降低了分离的压力，而且HILIC 色谱摒弃了离子对试剂，方便了制备色谱方法的开发。

HILIC 的优势及不足
通过上面我们介绍到的HILIC的机理及流动相和固定相的特征我们不难得出HILIC在分析极性化合物方面的优势。
首先，HILIC机理对于几乎所有的极性化合物都有较好的保留，大大解决了我们分析极性化合物时遇到的难以保留的问题。
其次，由于HILIC流动相有机相比例很高，所以对于质谱检测器来说，可以确保高效去溶剂化，大大提高化合物的信噪比。
另外，较高的有机相比例组成也会带来更低的色谱柱压力，在这个基础上，我们采用小粒径或者小内经的色谱柱时就不会受到压力的困扰。

HILIC的优势是很明显的，但是对于任何一种分离手段，也都存在一些不足之处。由于HILIC保留机理比较复杂，所以在方法优化及色谱柱选择上会比普通反相色谱柱要复杂。
HILIC保留机理由于需要形成富水层，所以色谱柱平衡时间会稍长，建议是普通反相的2-3倍，当然，这个问题其实在反相采用离子对试剂分析的时候也会碰到。另外，由于极性化合物在水中的溶解性好，但是如果我们采用纯水相来溶剂样品的话，有时候会出现溶剂效应带来的色谱峰展宽，就如同我们反相分析时用纯有机相溶解样品有时也会出现类似的问题。
所以，建议采用纯有机相或者与流动相比例接近的溶剂来溶解样品。

通过以上关于HILIC的介绍，相信大家对HILIC有了更进一步的了解。在以后我们分析极性化合物方面又多了一个更有力的工具！

当然这些比较经典的方法对于很多极性化合物的分析效果都是不错的，但是都会面临一些问题。

比如，加入离子对试剂，本身离子对试剂对于色谱柱的寿命会有一定的影响，流动相制备也相对复杂，另外很多时候也没法与质谱兼容；采用极性封端类的柱子，流动相中会用到比较高比例的水，压力会比较高，而且即使水相比例较高，对于一些很强极性的物质，仍然难以得到很好地保留。而HILIC可以克服以上的缺点，大大满足您对极性化合物的分析要求。

HILIC是 Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography（亲水作用液相色谱）的简称。我们首先要清楚，HILIC不是某个厂家的色谱柱系列或品牌，也不是某个键合相，它代表的是一种分离机理，而具备这种分离机理的键合相种类非常多。
在HILIC中，固定相是极性的，流动相中的水相部分表现为强洗脱溶剂，这与传统的反相色谱法完全相反。

HILIC 发展历史
HILIC分离模式最早可以追溯到1951年，Gregor等人描述了一种离子交换树脂表面的富水层概念，在1975年的时候，科学家在氨基柱上实现了糖类的分析也是属于HILIC的机理，但是直到1990年科学家Alpert才正式提出了HILIC的概念,但是这时候HILIC并没有得到广泛的推广，到了2000年以后，越来越多的人开始认识并使用HILIC机理进行极性化合物的分析，HILIC才得到了广泛的认可。

HILIC 的作用机理
HILIC可以被认为是反相液相色谱通过采用极性固定相来运行的。
HILIC中采用的流动相是含有少量水/缓冲盐或其他极性溶剂的高比例有机相（>60%，常用乙腈）。
流动相中的水形成一个富水层被吸附在固定相表面，极性物质首先进入富水层得到保留。
极性化合物是通过一个复杂的混合模式被保留的，包括：富水层和流动相之间的亲水分配、极性官能团和固定相间的氢键作用以及离子官能团的静电作用。
当然，亲水分配是最主要的保留模式。
从保留机理来看，HILIC和反相色谱柱是有着非常大的差别的。

HILIC 流动相
HILIC最常用的流动相是乙腈/水系统。
比例：有机溶剂>60%，流动相中至少需要3%的水相（因为HILIC保留机理是通过形成富水层来实现的）。
洗脱强度：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇 <甲醇<水。
对于条件摸索来说，等度条件下建议80%乙腈为起始条件来调整比例；梯度条件建议95%乙腈------60%乙腈。
对于HILIC来说，我们有时也会在流动相中加入缓冲盐，建议使用甲酸铵/乙酸铵（常用乙酸铵）缓冲液，可以同时满足溶解度（醋酸盐在高比例乙腈中溶解度较好）以及质谱检测器兼容性的要求。

HILIC 固定相
上面我们提到，HILIC保留机理的固定相种类非常多。常用的包括：
1，裸硅胶（如赛默飞的Hypersil Silica, SyncronisSilica及Accucore HILIC等），这种固定相在HILIC中也是应用最广泛的固定相，未键合硅胶由于表面具有硅羟基，具有一定的阳离子交换活性，所以可以增强对碱性化合物的保留。
2，两性离子固定相（如Syncronis HILIC）,此种固定相既有阳离子基团，又有阴离子基团，二者比例1：1，因此表面静电荷为零。对于分析中性极性化合物是一个不错的选择。
3，酰胺键合相（如Accocore Amide HILIC）,通过丙基或者专有连接基团将酰胺官能团键合到硅胶表面，此种键合相能够提供固定相和分析物之间的强有力的氢键作用，绝对保留能力强，对于碳水化合物分析是一个不错的选择，如聚糖的分析。酰胺键合相不太容易产生不可逆吸附（氨丙基固定相经常会遇到这样的问题），同时酰胺类色谱柱表现出良好的重现性和稳定性。其他的HILIC固定相包括：二醇基、氨丙基（氨基柱）、氰丙基（氰基柱）以及其他专有的特殊官能团键合相。

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