通过RP-HPLC分析和纯化蛋白以及多肽
贺文君
RP-HPLC在蛋白质研究中占据了非常重要的位置，用途广泛，检测的灵敏度高以及可以串联质谱，可以用于分离结构非常相似的蛋白以及多肽类成分.
蛋白以及多肽在反相中的分离机制主要是吸附和解吸附的一个过程。
在反相HPLC中，颗粒表面是十分疏水的，通过疏水表面对蛋白质的一面（被称为“疏水足”）吸附，蛋白质被保留下来。
与疏水表面的厚度相比，蛋白质要大得多，因此蛋白质仅有一部分被疏水表面所吸附。
大部分蛋白质位于表面上方与流动相接触（蛋白质的大部分是在疏水面之上与流动相接触）。
由这种疏水性吸附所导致的净相互作用非常强，会导致蛋白质保持吸附在表面上直至接触到特定浓度的有机溶剂，这时蛋白质会从表面上解吸附并从色谱柱上洗脱
色谱柱的考量：
1，超纯超惰性硅胶对于蛋白多肽化合物的峰形至关重要。硅胶的纯度，高纯度的硅胶在多肽以及蛋白的分析中，即便在非常低浓度的离子对试剂中都能获得极佳的峰形和分辨率。
超惰性硅胶柱往往需要极少量TFA也可获得不错的峰形，这点对LC-MS很有利。
2，色谱柱的长度方面，色谱柱的长度对于多肽分离而言不是一个重要的影响参数，色谱柱的长度对于多肽以及蛋白水解产物会有更大的影响。
为减小分析时间，短柱可以做为首先考虑。对蛋白分析而言，因为洗脱机理的原因，长短柱对分离度并不会有什么明显影响，这点和化学小分子完全不同。
但是对于小分子多肽，往往长柱比短柱的分离度大，这点类似化学小分子。
3，色谱柱的内径，标准的HPLC色谱柱的内径一般是 4.6mm. 相对于标准的分析柱内径而言，窄的内径会有更高的灵敏度。
4，对于色谱柱固定相的选择方面，ACT公司推出了生物分析方法开发包，主要提供三种固定相，C18-300, C4-300,Phenyl-300，提供三种不同的分离选择性作为主流用柱。
另外，对于大分子蛋白的反相用柱选择还有C8-300, CN-300作为补充选择用柱。
流动相的考量：
1，有机相的选择：
乙腈：广泛用于反相色谱中分析聚合多肽。易挥发且洗脱能力强低的粘度和低的背压比较透明，所以紫外吸收弱有很长的使用历史。
异丙醇：很少用作单独的流动相，因为粘度比较高。主要作为一种添加剂，一般添加浓度为1~5%，用于洗脱强疏水性的蛋白或多肽。
其他的流动相：甲醇或乙醇很少用于疏水性的蛋白质分析，由于乙醇的低毒性，常用于纯化蛋白质。
2，梯度洗脱：一般情况下，梯度变化的越慢，分辨率越高。
在分析时间变化不大的前提下，通过调节梯度变化来优化条件是非常有意义的，但是也有相反的情况。
在RP-HPLC中，蛋白和多肽的保留和一般的小分子化合物有所不同，等度洗脱对于蛋白质的分离作用很小，有机相比例小的变化会引起蛋白质保留的大的变化。
3，离子对试剂，在PR-HPLC分析蛋白或者多肽的过程中，为了获得更好的峰形，通常会在流动相中加入一些离子对试剂。
三氟乙酸：使用最广泛，在分析得到的峰形相似的情况下，硅胶纯度越高，使用的离子对试剂浓度可以相对更低。
其他可供选择的离子对试剂：磷酸和七氟丁酸也会用于蛋白和多肽的分离。
4，pH对多肽保留的影响：在反相色谱中， 多肽的分离一般在酸性环境下进行。
在低的pH值条件下，多肽中的端基羧基以及侧链的天冬氨酸和谷氨酸会质子化，从而增强保留。
反之，在碱性或中性条件下，会离子化，疏水作用降低，保留减弱。
温度的影响:
柱温以及流动相的温度从两方面影响多肽的分离：
温度升高，保留时间会有一定程度的降低；
温度升高会对多肽分离的选择性有一定程度的影响，因此选择适当的温度，对多肽分离，尤其是肽图分析显得尤为重要。
