液相色谱-三重四级杆质谱联用仪在雷尼替丁NDMA杂质检测中的应用实例
作者：上海熙华
王吉超、黄浩集
NDMA（N-二甲基亚硝胺），本是一个普普通通的化合物，却因为2018年的缬沙坦事件红遍大江南北，直至冲出亚洲走向世界。就在人们慢慢熟悉它、了解它，并觉得可以检测它、控制它的时候，诺华又爆出其雷尼替丁中NDMA超标，继而又在传统老药-二甲双胍中发现了它的存在。真是一波未平，一波又起……
值得注意的是，有报道称雷尼替丁在使用HS-GC-MS/MS方法检测的时候，会出现假阳性结果。有研究表明，该结果是因为部分雷尼替丁样品在GC进样口的高温环境下降解产生NDMA导致（图1）。也许是冥冥之中早有定数，雷尼替丁作为一个普通的组胺H2受体阻断剂，早在2012年【1】和2014年【2】就被当作模型化合物用于研究三级胺的亚硝酸化反应（图2）。上述文献显示，雷尼替丁在氧化剂的作用下（NH2Cl，注意不是氯化铵，该化合物是一种消毒剂）作用下，能够通过一系列复杂的分子内反应生成NDMA。
综上，为了应对假阳性结果可能导致的冤假错案，FDA随即开发了一个LC-HRMS方法用于该产品NDMA杂质的检测（见附件，下载方式见下方“参考文献”区域）。回过头来看这个方法，有很多精妙之处：
首先，使用液相系统进行分离就避免了气相导致的API进样口热分解问题；其次，该方法使用了一根ACE C18-AR柱（C18链有芳香基团修饰），解决了NDMA这类大极性物质的保留问题。最后，因为使用了高分辨质谱，使得该方法具有非常优异的专属性，尽可能地避免了低分子量区的背景干扰，提高了方法的灵敏度。然而，对于大部分医药生产企业来说，用一套高分辨液质联用系统来做常规的定量分析与检测工作，无疑是奢侈也是不现实的。
说到定量，毫无疑问，还是应该请我们分析定量界的王者-三重四极杆质谱上场。虽然属于低分辩质谱，但由于其独特的结构设计（图3），通过Q1筛选母离子，Q3筛选碎片离子来滤过干扰，大大降低了噪音信号，提高了分析灵敏度（图4）。
为了考察三重四极杆质谱对NDMA的检测能力，我们从几台API 6500plus液质系统（市面上灵敏度和稳定性最突出的三重四级杆质谱）中随机选择了一台并开展了试验(图5)。通过条件摸索，可知NDMA质子加合物在常规CID（碰撞诱导解离）条件下，主要碎裂为m/z 43和m/z 58两种碎片离子，推测其可能通过丢失甲醇分子以及羟基自由基【3】得到上述碎片（图6）。鉴于该原理，我们使用m/z 43为定量离子，m/z 58作为定性离子。如图7所示，使用FDA官方公布的液相条件，１ng/mL下NDMA对照品的信噪比为20.3，2ng/mL时为61.7，六针峰面积的RSD为2.5％。在有雷尼替丁及其制剂加标的情况下，回收率在90%以上，结果令人满意。但另一方面，我们发现该方法的基线噪音异常地高。这也比较容易理解，因为NDMA质子化后，质荷比只有75，非常容易受到空气、溶剂以及缓冲盐体系中小分子杂质的干扰，导致噪音较大。
如上所述，三重四极杆质谱对NDMA的检测能力令人满意，我们相信类似的方法对于NDEA的检测效果会更佳。因为NDEA的分子量为102，受低分子量区杂质的干扰更小，理论上应该有更好的灵敏度。如图9所示，在0.1ng/mL浓度下，NDEA的信噪比达到55，证实了上述推测。
综上，虽然HS-GC-MS/MS和LC-HRMS在亚硝胺类杂质检测方面分别具有适用性广和专属性高的优势，但常见的三重四极杆质谱同样不落下风，且由于其保有量较高，定量效果好，更适合在药厂及检验检测机构中推广。
最后轻松一下，附上食品中常见亚硝胺类杂质的含量情况，爱吃腊制食品的朋友们可以算算今天摄入了多少NDMA。
1. Julien Le Roux, Hervé Gallard, Jean-Philippe Croué, Sébastien Papot, and Marie Deborde. NDMA formation by chloramination of ranitidine: kinetics and mechanism. Environ. Sci. Technol. 2012, 46 (20), 11095−11103.
2. Yong Dong Liu, Meric Selbes, Chengchu Zeng, Rugang Zhong, and Tanju Karanfil. Formation Mechanism of NDMA from Ranitidine, Trimethylamine, and Other Tertiary Amines during Chloramination: A Computational Study. Environ. Sci. Technol. 2014, 48 (20), 8653−8663.
3. Yuan Yuan Zhao, Xin Liu, Jessica M. Boyd, Feng Qin, Jianjun Li, and Xing-Fang Li. Identification of N-Nitrosamines in Treated Drinking Water Using Nanoelectrospray Ionization High-Field AsymmetricWaveform Ion Mobility Spectrometry with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science. 2009, 47, 92-96.
