菲罗门技术部电话日常：
— 我（ 董丽华）：您好，菲罗门技术部，请问有什么可以帮助您？
— 客户：新柱子，测出来的柱效咋这么低？柱子是不是有问题？肿么回事？
我内心：“听，那是心碎的声音。死亡三联问，击碎了我弱小脆弱的心。突然想到，与其每次授人以鱼，不如借此平台授人以渔。”
言归正传喽
首先，常识是：新色谱柱拿到手里，一定要进行色谱柱效能测试。这样，先判断这根色谱柱是否是合格品，很关键的一点是，及时测试柱效后发现问题。
一经核实，可向厂家提出退换货。一旦色谱柱正常使用，后续再出现问题，用户很难向厂家申请到退换货的。所以，做新柱子的性能测试，可以保证您的利益。
我们先来了解下色谱柱效能评价（以下以反相色谱柱作为例子）
一、反相色谱柱评价条件
对于一根填充柱来说，最基本的柱性能评价指标是柱效和峰对称的测定。反相色谱柱评价所需常用的流动相一般是甲醇或者乙腈与水的体系，对于含有酸碱性组份的样品，流动相为甲醇或者乙腈与缓冲盐的体系；检测波长一般在254nm下检测，因为在此波长处，甲醇、乙腈，磷酸缓冲盐均没有紫外吸收，而且标准样品多为含苯环的物质，在254nm波长紫外吸收强，选择此波长检测可以避免流动相戏外吸收的干扰；柱温一般在室温下测定，均不超过30℃；对于通常的标准柱型，即Φ4.6mm×250mm的柱子来说，流速以1ml/min为宜。
柱压则为实测值，它不仅与色谱柱有关，而且取决于流动相，以及评价色谱柱的温度与流速。
二、反相色谱柱评价的标准物质
通常,以指定的一组标准溶质为样品,测定它们在柱子上的理论塔板数，以作为柱效的衡量指标。这种标准溶质的选择，因不同的色谱模式而异，也因不同的使用目的而有所不同。一般情况下，仅选用3-4中中性，例如芳香烃，最多选用5种。要求它们具有不同的保留因子（例如，第一个化合物k=0，其余的在2～10范围内），能反映出对柱子性质的基本要求，而且能在一般的HPLC装置上得到清晰的信号。反相色谱柱评价所用的标准样品各不相同，
采用NaNO3,NH2NO3，尿嘧啶，硫脲等作为样品，进行死时间的测定，一般可得较近的结果。虽然很多资料证实尿嘧啶有保留，但因其峰型相对较好等原因一直得到广泛得应用。
衡量柱效的物质则千差万别，由苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等，一般以最后洗脱出的组分衡量柱效（可以弱化死体积的影响外，同时与色谱柱填料充分接触）。
衡量色谱柱分离碱性样品的柱效，不对称度，可用阿米替林。
三、可能的影响柱效的因素（除色谱柱本身）
这里我们先不谈峰的对称性，当峰不对称的时候，柱效一定低的，我们暂时只考虑柱效低的影响因素有哪些。
柱外效应是指色谱柱之外的造成色谱峰展宽的成因，从进样系统到检测器之间色谱柱以外流路部分，主要由进样装置、检测池及它们与柱之间的连接管路所产生，并对柱效能产生的影响。
进样装置的影响：例如手动进样，样品注射的速度影响样品的扩散范围大小，使峰展宽，影响柱效。
检测池的影响：检测池体积大，使样品被流动相稀释，不仅会降低检测灵敏度，还使峰展宽。除了池体积大小的影响外，池的结构特点（几何形状）和池内的流动特性（从连接管到样品池由于直径变化引起的）都会影响峰展宽。假如样本同时达到检测池，通过纵向和横向扩散，在检测池中扩散的范围极端值为检测室的体积。所以池体积小，峰展宽会小。目前使用的检测池体积大多数都小于等于8μL，对于常规分析一般没有多大影响。另外，当使用小体积高效柱时，故希望检测池体积小于5μL，微量色谱柱的体积应减少到1μL，甚至更小。
连接管对色谱峰扩展的影响，是由于流动相在空管中的流动速度分布的纵断面呈抛物线状，管中心的样品分子比管壁部分的样品分子先到达样品池，因此引起了峰扩展。检测池与色谱柱出口的连接，或者几个检测器之间的连接，应采用细内径连接管并控制最短的距离，以使峰扩展最小。但应注意，连接管内径减小时，管内压力降会有所增加。一般最好使用内径0.1mm(或0.2mm)的不锈钢或PEEK管,长度应尽可能地短。
题外话：有时候做方法时，理论上两个物质的分离度大于1.5，但实际最好达2.0，因为不同仪器的样品池和连接管对峰扩展的贡献有可能使在色谱柱上已经分离了的组分在样品池中又重叠混合，转移后的方法重现不出。
检测器的参数影响。检测器的时间常数包括检测器传感器和电子元件的响应时间，它间接对色谱系统的最小检测量和最低检测浓度产生影响。一般说来，传感器的响应较快。而检测器放大器和记录仪的时间常数有可能过大，使色谱峰变形失真，导致柱效下降，也影响色谱分析的可靠性和准确性。目前使用的检测器和记录仪的时间常数一般在0.5s-1.0s 就是合适的。
标准物质的浓度与进样体积的影响。用两个极端（正常至超载连续图）的例子，用柱效的数学来解释原理。N=16(tR/W)2.其中tR是保留时间；W为峰宽。
左图：样品质量对峰宽和峰型的影响,峰1到峰4，进样质量逐渐增大。
右图：样品体积对峰宽和峰型的影响,峰1到峰4，进样体积逐渐增大。
上面的图显示，随着样品质量和体积的增大，W增大的程度远大于tR增量，所以tR/W总比值是变小的，此比值与柱效呈正相关，所以柱效会下降。
四、总结
通过上述的讲解，大家有没有明白柱效为什么会降低呢？有没有体会到拥有“渔技”的快乐？有没有内心从容一些？
色谱柱在出厂的过程中有专门优化过的机器来进行色谱柱测试性能，各方面条件和现实中是有差异。所以新购来的柱子在实验室中所测得的柱效，往往低于生产厂家给出的柱效。
色谱柱测试时，可以根据厂家随柱附带的测试报告来测试。当然，各实验室可根据自己的要求配制自己的标准溶质。
我们技术部建议：第一次柱测试，最好和厂家提供的标准图相比较，选用与厂家相同的测试条件，有可靠的参考标准。
1. 常规HPLC色谱柱，数值超过柱报告柱效上70%，则属于合格品。
2. 标准物质的浓度与进样体积，请向厂家询问清楚。
3. 测试物质选取的不同，作用也是不同的。对于柱效这个参数，一般测定混合物的较靠后面的峰的数值作为比较标准。
4. 在HPLC仪器上测试内径小于3mm的色谱柱时，柱效这个数据已经不准确，这个时候要关注出峰时间是否与柱报告上的物质相近（管路长短、宽窄引起时间微小差异），峰是否变形。最好UHPLC仪器来测定UHPLC的小粒径小体积柱。
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